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       原文鏈接：http://www.nyxxb.cn/cn/article/doi/10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0095

       隨著科技的發(fā)展，保護(hù)農(nóng)作物安全的方法越來(lái)越多，如：轉(zhuǎn)基因工程、生物農(nóng)藥等，但由于其發(fā)展速度較緩，且存在很多不可控因素，在未來(lái)幾十年內(nèi)，化學(xué)農(nóng)藥仍然在確保糧食安全上起著不可替代的作用。按照防治對(duì)象分類，化學(xué)農(nóng)藥主要分為除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑等，其中殺菌劑市場(chǎng)最小，品種最少，但由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，特別是復(fù)合型轉(zhuǎn)基因作物的普及，使得除草劑和殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)受到限制，殺菌劑市場(chǎng)發(fā)展迅速，其中以琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）為靶標(biāo)的殺菌劑發(fā)展最為迅速。2016 年，琥珀酸脫氫酶抑制劑類（SDHIs）殺菌劑的全球銷(xiāo)售額為16.91億美元，占564.52億美元全球農(nóng)藥市場(chǎng)的3.0%，占152.68億美元?dú)⒕鷦òǚ亲魑镉脷⒕鷦┦袌?chǎng)的11.1%。2011—2016年其復(fù)合增長(zhǎng)率最高（23.8%），超過(guò)了甲氧基丙烯酸酯類及三唑類等老牌殺菌劑，因此，SDHIs殺菌劑成為備受全球矚目的“一匹黑馬”。本文重點(diǎn)描述了靶向SDHIs殺菌劑的發(fā)展脈絡(luò)、作用機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系及抗性情況分布，旨在為新型SDHI的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

1  SDHIs殺菌劑的發(fā)展脈絡(luò)

       靶向琥珀酸脫氫酶的第1個(gè)商品化殺菌劑萎銹靈是由美國(guó)有利來(lái)路（現(xiàn)科聚亞）公司于1969年開(kāi)發(fā)上市的品種，萎銹靈有良好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，一般用于種子處理劑來(lái)防治禾谷類黑穗病，以及葉面噴霧方式防治禾谷銹病，萎銹靈的誕生同時(shí)也標(biāo)志著殺菌劑從保護(hù)性殺菌劑向內(nèi)吸性殺菌劑的方向發(fā)展。至今，SDHIs殺菌劑經(jīng)歷了50年的發(fā)展，其殺菌譜不斷拓展，已從最早期的種子處理，擴(kuò)展到水稻病害的防治，再拓展到現(xiàn)在用于大田作物、果蔬、經(jīng)濟(jì)作物以及觀賞類植物病害的防治。本部分將以SDHIs殺菌劑的殺菌譜為主線進(jìn)行闡述。

       1975年，美國(guó)有利來(lái)路公司基于萎銹靈又成功報(bào)道了氧化萎銹，主要用于防治銹病。此后，很多公司開(kāi)始參與其中，如日本組合化學(xué)、日本農(nóng)藥、巴斯夫、殼牌 (現(xiàn)拜耳)、住友化學(xué)、孟山都及先正達(dá)等10余家，相繼開(kāi)發(fā)出滅銹胺（1981年，日本組合化學(xué)）、氟酰胺（1986年，日本農(nóng)藥）、麥銹靈（1986年，巴斯夫）、甲呋酰胺（1974年，殼牌）和呋吡菌胺（1997年，住友化學(xué)），但這些品種的殺菌譜均較窄，大多用于種子處理。

       直到1997年，由孟山都公司開(kāi)發(fā)出噻呋酰胺，它具有比較強(qiáng)的內(nèi)吸傳導(dǎo)性及較長(zhǎng)的持效性，針對(duì)很多病害都有良好的防治效果，是長(zhǎng)久以來(lái)被用于防治水稻紋枯病的良藥，但其在其他作物病害方面的利用極少，效果也并不顯著。噻呋酰胺命途多舛，首次由孟山都研制成功，1994年賣(mài)與羅門(mén)哈斯并進(jìn)行生產(chǎn)，2001年羅門(mén)哈斯并入美國(guó)陶氏益農(nóng)公司，此后又被日產(chǎn)化學(xué)獲得，經(jīng)歷了幾番變故，同時(shí)考慮其成本問(wèn)題，且水稻紋枯病主要集中在中國(guó)和印度，在東南亞地區(qū)紋枯病發(fā)病并不嚴(yán)重，日產(chǎn)化學(xué)對(duì)其推廣并不成功。因此必須在控制成本的前提下拓寬殺菌譜，爭(zhēng)取用于更多作物病害的防治。

       令人欣喜的是，2003年由巴斯夫創(chuàng)制的啶酰菌胺橫空出世，這也是史上第1個(gè)廣譜性的SDHIs殺菌劑，僅僅上市2年，銷(xiāo)量便以驚人的速率增加，一舉步入上億美元的產(chǎn)品之列。不同于早期開(kāi)發(fā)的萎銹靈，啶酰菌胺殺菌譜很廣，幾乎對(duì)于所有類型的真菌病害都有防效，主要用于白粉病、褐腐病、葉斑病、灰霉病、菌核病以及由鏈格孢菌等引起的病害的防治，并且對(duì)其他藥劑已產(chǎn)生抗性的菌株也有效。啶酰菌胺具有優(yōu)異的預(yù)防作用，并有一定的治療效果，2007年便已用于上百種作物上防治多種病害，成為巴斯夫公司炙手可熱的產(chǎn)品，即便到了現(xiàn)在，啶酰菌胺的銷(xiāo)售額也是前3名，這也一舉讓巴斯夫成為SDHIs殺菌劑的領(lǐng)頭羊。至此，SDHIs殺菌劑家族真正受到全球行業(yè)內(nèi)各大農(nóng)藥公司的廣泛關(guān)注。隨后巴斯夫公司在對(duì)啶酰菌胺進(jìn)一步優(yōu)化中又發(fā)現(xiàn)了一重磅產(chǎn)品——氟唑菌酰胺（2011年，巴斯夫），它也是SDHIs殺菌劑，具有很好的預(yù)防和治療活性，用于防治廣譜的真菌病害，可用于近百種作物，如谷類作物、豆類蔬菜、油料作物和花生等，氟唑菌酰胺具有高效、廣譜、持效性強(qiáng)、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)還具有優(yōu)異的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，耐雨水沖刷，其于2011年上市，2012年便取得了近1億美元的銷(xiāo)售額，此后銷(xiāo)量逐年增加，2015年其銷(xiāo)售額也首次超過(guò)了啶酰菌胺，達(dá)到了3.9億美元，成為了SDHIs殺菌劑中當(dāng)之無(wú)愧的王者。

       巴斯夫公司開(kāi)創(chuàng)性的研究，使SDHIs得到了空前的發(fā)展，此后高效廣譜性的SDHIs殺菌劑的發(fā)展猶如雨后春筍般涌現(xiàn)，聯(lián)苯吡菌胺（2011 年，拜耳）、氟唑環(huán)菌胺（2011年，先正達(dá)）、氟唑菌苯胺（2012年，拜耳）、氟吡菌酰胺（2012年，拜耳）、苯并烯氟菌唑（2012年，先正達(dá)）、異丙噻菌胺（2015年，日本石原）、氟唑菌酰羥胺（2016年，先正達(dá)）、pyraziflumid（2018年，日本農(nóng)藥）及isoflucypram（預(yù)計(jì)2020 年上市，拜耳）等陸續(xù)被創(chuàng)制并推向市場(chǎng)。2017年，本課題組通過(guò)藥效團(tuán)連接碎片的虛擬篩選方法成功得到了用于水稻紋枯病防治的廣譜性農(nóng)藥候選化合物氟苯醚酰胺以及氯苯醚酰胺。

       隨著越來(lái)越多的科研工作者參與到SDHIs殺菌劑的農(nóng)藥創(chuàng)制中，如今琥珀酸脫氫酶已經(jīng)是不可忽視的重要?dú)⒕鷦┌袠?biāo)，可以預(yù)見(jiàn)，未來(lái)廣譜高效SDHIs殺菌劑必將成為殺菌劑的主導(dǎo)。

2  SDHIs殺菌劑的作用機(jī)制

       琥珀酸脫氫酶又稱線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ（EC1.3.5.1），它是三羧酸循環(huán)的功能部分，與線粒體電子傳遞鏈相連，催化從琥珀酸氧化到延胡索酸和從泛醌還原到醌的偶聯(lián)反應(yīng)；它由4個(gè)亞單位共同組成：黃素蛋白（FP，含1個(gè)共價(jià)結(jié)合的FAD輔因子）、鐵硫蛋白（IP，含3個(gè)鐵硫中心）和另外2種嵌膜蛋白（大的細(xì)胞色素結(jié)合蛋白CytbL和小的細(xì)胞色素結(jié)合蛋白CytbS）（圖1A）。FP和IP組成該復(fù)合體的可溶部分，具有琥珀酸脫氫酶活性；CytbL和CytbS兩種嵌膜蛋白將FP、IP固定在內(nèi)膜上，且具有泛醌還原酶活性。SDHI類殺菌劑就是通過(guò)完全或者部分占據(jù)底物泛醌的位點(diǎn)，抑制了電子從琥珀酸到泛醌的傳遞，從而阻斷了病原菌的能量代謝，抑制病原菌的生長(zhǎng)、導(dǎo)致其死亡，最終達(dá)到防治植物病害的目的。

       近年來(lái)，關(guān)于SDH的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究取得了重要進(jìn)展。Iverson等最早于1999年解析了大腸桿菌Escherichia coli QFR（quinol: fumarate oxidoreductase）的三維結(jié)構(gòu)（0.33 nm）；同年11月，Lancaster 等解析了Wolinella succinogenes中QFR 的三維結(jié)構(gòu)（0.22 nm）；2003年，Iwata領(lǐng)導(dǎo)的小組獲得了分辨率更高的大腸桿菌SDH的晶體結(jié)構(gòu)（0.26 nm）；2005年，饒子和研究組首次報(bào)道了豬心SDH的晶體結(jié)構(gòu) （0.24 nm）以及結(jié)合有抑制劑3-硝基丙酸鹽（3-NPA）、TTFA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（0.35 nm）。同年，Berry 研究組報(bào)道了目前解析度最高的雞心SDH的結(jié)構(gòu)（PDB code: 2FBW, 0.21 nm）。研究表明，SDH存在一個(gè)Qp結(jié)合位點(diǎn)，商品化殺菌劑萎銹靈（carboxin）即結(jié)合在該位點(diǎn)上（圖1B）。

圖1  A. 雞心SDH的三維結(jié)構(gòu)顯示圖；B. carboxin與SDH結(jié)合方式顯示圖；C. boscalid與SDH結(jié)合方式顯示圖

       隨后，我們基于已有的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和生物學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)10個(gè)商品化殺菌劑與SDH的作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該類抑制劑的酸部分插入了活性腔底部，與C_R46形成離子-π相互作用，酰胺鍵中氧原子與B_W173和D_Y91形成Hbond，胺部分伸向活性腔口部分，如圖1C所示，boscalid中胺部分的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)伸向活性腔口，與C_W35形成π-π相互作用。

3  SDHIs殺菌劑的構(gòu)效關(guān)系

       目前已經(jīng)上市的SDHI的化學(xué)結(jié)構(gòu)中無(wú)一“缺席”酰胺鍵，所以又稱為酰胺類殺菌劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中主要包含羧酸部分、酰胺鍵部分和胺部分（圖式1）。

       縱觀目前已有的SDHIs殺菌劑，其中不難發(fā)現(xiàn)，羧酸部分歷經(jīng)50年改變并不大，主要為氧硫雜環(huán)己二烯、苯基、呋喃、噻吩和吡唑等，其中羧酸部分為吡唑的商品化品種就有11個(gè)之多，吡唑環(huán)的引入大大增強(qiáng)了其活性，如氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑和氟唑菌酰羥胺等。近年來(lái)，全球各大農(nóng)藥公司也在對(duì)酸部分進(jìn)行改造，其中一個(gè)值得注意的商品化品種是由日本株式會(huì)社公司開(kāi)發(fā)的pyraziflumid，其創(chuàng)新點(diǎn)在于羧酸部分引入了吡嗪片段，主要用于水稻、果樹(shù)、蔬菜和草坪等防治白粉病、黑星病、灰霉病、菌核病、輪紋病、果斑病和幣斑病等。Pyraziflumid的成功開(kāi)發(fā)說(shuō)明了羧酸部分也是一個(gè)重要的突破點(diǎn)。目前中國(guó)也有很多對(duì)羧酸部分進(jìn)行改造的案例，雖然結(jié)果并不太理想，但仍然是一個(gè)值得考慮的方向，若能成功開(kāi)發(fā)出新的羧酸部分，在如今激烈的競(jìng)爭(zhēng)中必將有一席之地。

圖式1  商品化的琥珀酸脫氫酶抑制劑類（SDHIs）殺菌劑的基本骨架

       與此同時(shí)，羧酸部分氟原子的引入有利于提高化合物的生物活性，在23個(gè)商品化品種中，其中有19個(gè)品種的酸部分含有氟原子，主要由于其具有較小的原子半徑、高的電負(fù)性、碳-氟鍵能高（使得含氟化合物雖然能夠參與代謝過(guò)程，但是又具有明顯的抗代謝性）、增加有機(jī)分子的親脂性（使得含氟化合物在生物體內(nèi)對(duì)膜、組織的穿透能力增強(qiáng)，提高了含氟化合物在生物體內(nèi)的吸收和傳輸速度）?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，氟原子在藥物設(shè)計(jì)中承擔(dān)著改變分子穩(wěn)定性、親脂性、酸堿性和構(gòu)型等重要作用，這在SDHIs殺菌劑中也同樣表現(xiàn)的搶眼。本課題組在前期工作中，同樣在吡唑羧酸部分引入了二氟甲基和三氟甲基，構(gòu)效關(guān)系研究表明：二氟甲基取代的化合物的活性優(yōu)于三氟甲基，主要是由于二氟甲基的引入，可與D_D90氨基酸殘基形成氫鍵或形成分子內(nèi)氫鍵，使得其與琥珀酸脫氫酶的結(jié)合自由能優(yōu)于三氟甲基。

       早期的研究表明，酰胺鍵是較為保守的，如萎銹靈、啶酰菌胺和聯(lián)苯吡菌胺等，但是直到2016年先正達(dá)開(kāi)發(fā)上市了氟唑菌酰羥胺，其N原子上進(jìn)行了甲氧基取代，這是先正達(dá)公司開(kāi)發(fā)的又一個(gè)“重磅炸彈”，其廣譜且高效，適用于多種作物。先正達(dá)指出，在所有化學(xué)類型的產(chǎn)品中，氟唑菌酰羥胺對(duì)葉斑病和白粉病的活性最高，而這兩種病害又是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常見(jiàn)的病害；另外氟唑菌酰羥胺對(duì)難以防治的病害，如葡萄孢菌（Botrytis spp.）、核盤(pán)菌（Sclerotinia spp.）和棒孢菌（Corynespora spp.）等病原菌引起的病害也有較好的防效；氟唑菌酰羥胺還突破性地防治谷物上由鐮刀菌（Fusarium）引起的病害，如赤霉病等。緊隨其后，拜耳公司對(duì)酰胺鍵中N上取代基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)N原子進(jìn)行環(huán)丙基取代時(shí)可以有效地提高化合物活性，并成功開(kāi)發(fā)了isoflucypram，這也標(biāo)志著新型SDHIs殺菌劑已經(jīng)開(kāi)始誕生，其開(kāi)發(fā)空間依然廣闊無(wú)比。

       對(duì)于胺部分的結(jié)構(gòu)改造，如早期的萎銹靈和氧化萎銹靈，其胺部分僅為一個(gè)苯環(huán)，對(duì)其進(jìn)行修飾程度有限，造成病害防治上比較單一，殺菌譜相對(duì)較窄。2003年后，人們開(kāi)始對(duì)胺部分進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，增大了抑制劑的體積，使其能夠更好地與活性空腔結(jié)合，達(dá)到更好的抑制效果，如啶酰菌胺、聯(lián)苯吡菌胺（胺部分為聯(lián)苯）和苯并烯氟菌唑（胺部分為并環(huán)）。因此總體來(lái)說(shuō)，胺部分的設(shè)計(jì)策略大致有3種（圖式2）：并環(huán)策略（苯并烯氟菌唑）、聯(lián)苯策略（氟唑菌酰胺）和延長(zhǎng)鏈長(zhǎng)的策略（氟吡菌酰胺）。通過(guò)這3 種策略，各大農(nóng)藥公司相繼開(kāi)發(fā)出眾多具有廣譜高效的殺菌劑，如啶酰菌胺、氟唑菌酰胺、呋吡菌胺、聯(lián)苯吡菌胺、吡唑萘菌胺、苯并烯氟菌唑、氟吡菌酰胺等，創(chuàng)造了SDHIs殺菌劑的輝煌，也奠定了SDHIs殺菌劑在整個(gè)殺菌劑市場(chǎng)中的地位。

圖式2  SDHIs殺菌劑一般設(shè)計(jì)策略

       從防治的病害上來(lái)說(shuō)，SDHIs殺菌劑的殺菌譜已經(jīng)很廣，幾乎覆蓋所有的真菌病害，如：灰霉病、白粉病、紋枯病、赤霉病和銹病等，但在目前已上市的品種中，均沒(méi)有對(duì)黃瓜霜霉病等卵菌有較高防效的品種出現(xiàn)，這是令人遺憾的，也是令人期待的，未來(lái)若能夠開(kāi)發(fā)出可以有效防治卵菌病害的新品種，必定會(huì)成為該領(lǐng)域發(fā)展史上的又一個(gè)重要里程碑。

4  SDHIs殺菌劑的抗性

       由于靶標(biāo)的作用位點(diǎn)單一，殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（Fungicides Resistance Action Committee，FRAC）將SDHIs殺菌劑歸為中等至高抗性風(fēng)險(xiǎn)，目前已有10多種病原菌對(duì)SDHIs殺菌劑存在抗性。表1統(tǒng)計(jì)了截止2019年所報(bào)道的抗性位點(diǎn)及其物種來(lái)源，其中B_H267Y（等位于2FBW中B_H216）是一個(gè)抗性頻率較高的抗性位點(diǎn)，幾乎存在于所有的物種中。

表1  對(duì)SDHIs殺菌劑產(chǎn)生抗性的真菌物種、來(lái)源及突變體

       如圖2所示，以2FBW為基準(zhǔn)，顯示了部分突變氨基酸殘基在活性腔Q p中的分布情況，B_H216與抑制劑沒(méi)有形成直接的相互作用，同時(shí)表1所統(tǒng)計(jì)的抗性位點(diǎn)與抑制劑的距離不等，可以大致分為：活性腔內(nèi)抗性位點(diǎn)（如B_H216、B_P169、C_S39、C_I40）和活性腔外抗性位點(diǎn)（如B_T217、C_H105、C_H42、D_D57、B_R214）。本課題組前期關(guān)于B_H216Y的抗性機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：當(dāng)216號(hào)組氨酸突變成酪氨酸時(shí)，將破壞野生型中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使得抑制劑與受體的結(jié)合力減弱，進(jìn)而產(chǎn)生抗性（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

       隨著SDHIs殺菌劑的廣泛使用，抗性問(wèn)題必然發(fā)生，這也警示我們?cè)谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，必須控制其使用的次數(shù)及用藥的方式，以減緩抗性的發(fā)生。目前，SDHIs殺菌劑均在同一交互抗性組，隨著抗性的逐漸產(chǎn)生，未來(lái)可能有些品種還未上市便已產(chǎn)生抗性，這也為未來(lái)的設(shè)計(jì)提出了巨大的挑戰(zhàn)。

圖2  部分抗性位點(diǎn)在活性腔Qp中的分布情況(殘基編號(hào)為2FBW中編號(hào))

5  SDHIs殺菌劑未來(lái)發(fā)展的前景

       由于其作用位點(diǎn)單一，抗性風(fēng)險(xiǎn)的不斷擴(kuò)大，關(guān)于SDHIs殺菌劑的復(fù)配產(chǎn)品必將是未來(lái)重點(diǎn)之一，此外，SDHIs殺菌劑早期是從防治銹病開(kāi)始的，其對(duì)于擔(dān)子菌引起的病害防效優(yōu)異，隨著幾十年的發(fā)展，新型SDHIs殺菌劑已經(jīng)從擔(dān)子菌轉(zhuǎn)向了各種病菌的防治，如子囊菌、半知菌等，殺菌譜正在不斷擴(kuò)大，但令人遺憾的是，對(duì)于卵菌綱的病害，如黃瓜霜霉病、馬鈴薯晚疫病、辣椒疫霉病等，該類抑制劑均未表現(xiàn)出優(yōu)異的防效，這或許是未來(lái)SDHIs殺菌劑發(fā)展的另一重點(diǎn)，這可能需要更加新穎且有別于現(xiàn)有結(jié)合模式的結(jié)構(gòu)誕生。