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       由疫霉屬植物病原卵菌導(dǎo)致的多種作物疫病嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，殺菌劑的使用依然是目前疫病防控的主要手段之一。但當(dāng)前可供選擇的卵菌抑制劑種類相對較少，且單一作用位點(diǎn)藥劑的長期使用容易導(dǎo)致植物病原卵菌產(chǎn)生抗藥性問題，因此生產(chǎn)中迫切需要?jiǎng)?chuàng)建綠色安全、高效協(xié)同的作物疫病防控新策略。

       噴施誘導(dǎo)的基因沉默（SIGS）是基于RNA干擾（RNAi）的新型植物保護(hù)方法，已被報(bào)道對部分植物病原真菌具有較好的防治效果，但其發(fā)揮活性的分子機(jī)制尚不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）在不同病原菌—植物互作系統(tǒng)中被吸收、加工和利用的效率存在明顯的分化，因而導(dǎo)致其對不同的真菌或卵菌病害防治效果可能具有較大差異。其中，疫霉對dsRNA的吸收效率顯著低于灰葡萄孢菌、核盤菌、立枯絲核菌和大麗輪枝菌等大多數(shù)病原真菌。而且，疫霉體內(nèi)可通過基因沉默來有效抑制病原菌生長發(fā)育和侵染致病的靶標(biāo)基因尚不明確，這些因素極大制約了SIGS在作物疫病防治上的應(yīng)用。

       此前研究發(fā)現(xiàn)靶向卵菌保守的羧酸酰胺類（CAAs）殺菌劑靶標(biāo)蛋白纖維素合酶3（CesA3）和氟噻唑吡乙酮的靶標(biāo)氧化固醇結(jié)合蛋白1（OSBP1）的寄主誘導(dǎo)基因沉默（HIGS）可以顯著增強(qiáng)植物對辣椒疫霉的抗病性，且抗性水平與HIGS介體被寄主植物DCL3/DCL4加工形成的21-24 nt小RNA（small RNA, sRNA）的豐度呈正相關(guān)（Host-induced gene silencing of PcCesA3 and PcOSBP1 confers resistance to Phytophthora capsici in Nicotiana benthamiana through NbDCL3 and NbDCL4 processed small interfering RNAs. International Journal of Biological Macromolecules, 2022）。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步篩選獲得可靶向疫霉菌CesA3和OSBP1關(guān)鍵區(qū)域的CesA3-/OSBP1-dsRNAs，將其直接噴施于離體葉片或辣椒幼苗根莖部后能有效防治辣椒疫霉侵染。為進(jìn)一步提高SIGS效率，本研究制備了聚乙二醇異丙烯酸酯（PEGDA）功能化的碳點(diǎn)納米顆粒（CDs），其可以通過靜電結(jié)合等作用力高效裝載前期篩選獲得的dsRNA，從而形成dsRNA-CDs復(fù)合物。

       活性測定發(fā)現(xiàn)，核酸農(nóng)藥CesA3-/OSBP1-dsRNA-CDs對辣椒疫霉、致病疫霉和大豆疫霉引起的多種重要疫病均表現(xiàn)出良好的防治活性。與化學(xué)殺菌劑烯酰嗎啉和氟噻唑吡乙酮相比，核酸農(nóng)藥可有效抑制抗藥性菌株的侵染。同時(shí)，將相同靶標(biāo)的化學(xué)殺菌劑與dsRNA-CDs協(xié)同使用，在保證相同防效的基礎(chǔ)上可以將化學(xué)藥劑的使用量降低90%。以上研究表明，本研究開發(fā)的核酸農(nóng)藥dsRNA-CDs兼有作物疫病防治和抗性治理的作用，對化學(xué)農(nóng)藥的減量增效具有重要意義。

       同時(shí)，本研究從延長持效期、增強(qiáng)抗光解能力及緩解高溫的影響這3個(gè)方面進(jìn)一步明確了CDs對于dsRNA的保護(hù)和增效作用，并發(fā)現(xiàn)CDs可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用高效促進(jìn)dsRNA在植物和疫霉細(xì)胞的內(nèi)化吸收。CDs對dsRNA的協(xié)同增效作用主要基于其能夠中和dsRNA攜帶的負(fù)電荷，加劇dsRNA的折疊團(tuán)聚，從而促進(jìn)dsRNA在植物細(xì)胞中的吸收及釋放，進(jìn)而激發(fā)dsRNA相關(guān)sRNA在植物細(xì)胞的大量產(chǎn)生，最終顯著提高防病效果。

       進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SIGS與HIGS在發(fā)揮防病作用機(jī)制方面存在明顯差異。在SIGS中dsRNA主要通過植物RdRP1進(jìn)行加工形成20-30 nt的sRNA以發(fā)揮其跨界基因沉默的功能。有趣的是，SIGS形成的sRNA僅顯著抑制靶標(biāo)基因的翻譯，并不像HIGS介體相關(guān)sRNA一樣可直接導(dǎo)致疫霉體內(nèi)對應(yīng)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量發(fā)生變化。本研究表明SIGS介體主要通過植物RNAi系統(tǒng)形成多種長度的sRNA，這些小分子跨界進(jìn)入疫霉體內(nèi)后誘導(dǎo)翻譯水平的基因沉默。

       綜上，本研究基于高效的碳點(diǎn)納米遞送系統(tǒng)，建立了靶向疫霉關(guān)鍵基因的核酸農(nóng)藥體系，可同時(shí)防控多種植物疫病并可有效治理疫霉抗藥性。研究結(jié)果為植物病害的綠色防控提供了新的途徑，也為農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域RNA藥劑的有效遞送提供了安全可行的新方法。同時(shí)，明確CDs對于dsRNA的增效機(jī)理及SIGS發(fā)揮活性的分子機(jī)制將為進(jìn)一步提升核酸農(nóng)藥的生物活性提供理論指導(dǎo)，也為CDs介導(dǎo)的SIGS應(yīng)用于更多植物病害綠色防控奠定理論基礎(chǔ)。

       中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后王治文為第一作者，劉西莉教授為通訊作者，植物保護(hù)學(xué)院已畢業(yè)研究生李瑜和高翔，在讀研究生張博瑞、師夢茹、張思聰、鐘珊和鄭漾參與了該工作。研究受到國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題支持。